Principe :
La bilirubine du sérum réagit avec de l'acide sulfanilique diazoté pour former un composé coloré.
En présence d'un réactif de couplage (antipyrine ou acétamide), toute la bilirubine réagit.
L'addition d'acide phosphorique avant le couplage ne fait agir que la bilirubine conjuguée.

Prélèvement :
Réaliser un prélèvement de sang veineux recueilli sans anticoagulant. Centrifuger à pleine vitesse pendant 5 bonnes minutes. Séparer rapidement le sérum des globules grâce à une pastette.
Tout prélèvement hémolysé devra être traité avec suspicion. Si possible, réaliser un nouveau prélèvement.

Matériel :
6 tubes en verre de 10 ml, réactifs, photomètre.

Technique :
Utiliser 3 tubes pour le malade et 3 tubes pour la gamme d'étalonnage, valeurs en ml. On part d'un étalon de bilirubine totale de concentration 100 µmol/l.

	MALADE			GAMME D'ÉTALONNAGE (bili. totale)
Tube	Témoin	Conjuguée	Totale	10 µmol/l	50 µmol/l	100 µmol/l
Sérum ou étalon	0.5	0.5	0.5	0.05	0.25	0.5
NaCl 0.9 %				0.45	0.25
Réactif de diazotation		0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
Acide sulfanilique	0.8
Mélanger par agitation latérale et laisser reposer 15 minutes
Réactif de couplage			1.2	1.2	1.2	1.2
			Mélanger et laisser reposer 3 min
Acide phosphorique	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
Bien mélanger les tubes
Réactif de couplage	1.2	1.2
	Mélanger les tubes

• Photomètrer à 550-560 nm chaque tube en faisant le blanc sur le tube témoin.
• Construire la droite d'étalonnage de type : concentration = f (absorbance)
• Reporter les absorbances obtenues pour les tubes "totale" et "conjuguée" et lire les concentrations.
• Domaine de mesure : 0 -120 µmol/l
• Diluer au quart avec du sérum physiologique si > 120 µmol/l.

On a : Bilirubine libre = bilirubine totale - bilirubine conjuguée

On considère la gamme d'étalonnage stable une dizaine de jours, on passera le point  50 µmol/l comme contrôle lors de dosages répétés pendant ces 10 jours.

Réactifs :

Solution d'acide sulfanilique : Solution A

• Dans un flacon de 500 ml, mélanger 250 ml d'eau distillée, 56 ml d'HCl N et 1.9 g d'acide sulfanilique.
• Une fois que l'acide est dissous, compléter à 500 ml avec de l'eau distillée.
• La solution se conserve bien.

Solution de nitrite de sodium : Solution B

• Dissoudre 0.1 gramme de NaNO₂ dans 25 ml d'eau distillée.
• Se conserve 15 jours au réfrigérateur en flacon brun.

Réactif de diazotation : A faire juste avant le dosage, ne pas conserver après usage
Mélanger 10 ml de solution A avec 200 µl de solution B.

Réactif de couplage :

Dans un flacon de 500 ml, mettre 300 ml d'eau distillée et dissoudre :

• 10 grammes d'acétamide pur (CH₃CONH₂)
• 75 grammes d'urée
• 40 grammes d'acétate de sodium cristallisé (CH₃COONa, 3H₂O)

Compléter à 500 ml avec de l'eau distillée, le réactif se conserve bien

Solution d'acide phosphorique :

• Dans un flacon de 500 ml, mettre 150 ml de solution d'acide orthophosphorique à 85 % (H₃PO₄)
• Compléter à 500 ml avec de l'eau distillée, le réactif se conserve bien

Fiche technique :

BILIRUBINES T ET D	Dosage	Cond	Prix	Revend.	Réf.	Temps de manipulation	15	mn
						Temps d'incubation	18	mn
Acétamide	solide	250g	159 F	Fisher	A4700308	Frais d'eau distillée	0.30 F
Acétate de Na cristallisé	solide	500g	101 F	Fisher	A4321130	Frais de chauffage	- F
Acide chlorhydrique	36%	2,5 litres	140 F	Fisher	A4705202	Consommables + étalon	0.20 F
Acide phosphorique	85%	1 litre	117 F	Fisher	A4713501	Total frais annexes	0.50 F
Acide sulfanilique	solide	25g	286 F	Fisher	A4715505	Amortisst photomètre	1.00 F
Nitrite de Na	solide	250g	115 F	Fisher	A4896308	Coût en réactif par test	0.58 F	bili.T,D
Urée	solide	500g	106 F	Fisher	A4321285	Forfait technicien	0.50 F
		TOTAL	1 024 F			Total général	2.58 F	bili.T,D
Coût en réactif par test	0.58 F	pour	6 000	tests
Poids du kit	5 Kg	soit	1 750	patients	(T + D)